Слід провести обрізку хвоста за допомогою гострого скальпеля, ножиць або чистого леза бритви видаліть 1-3 мм від кінчика хвоста. 3. Якщо стрижки хвоста виконуються на кількох тваринах, рекомендується використовувати нове лезо скальпеля для кожної миші. Ножиці необхідно очистити етанолом між кожною твариною.
Процедура
- Помістіть приблизно 2-3 мм кліпсу для вуха, хвіст або іншу біопсію тканини в кожну пробірку для ПЛР у міру їх отримання.
- Додайте 75 мкл 50 мМ NaOH у пробірку для ПЛР. …
- Інкубуйте в термоциклері при 95 °C від 30 хвилин до 1 години. …
- Відразу перекидаємо трубочки. …
- Дайте зразкам охолонути до кімнатної температури (RT).
- Коротко відкрутіть, щоб видалити рідину з кришок.
Екстракція ДНК тваринної тканини та протокол ампліфікації WGA
- Помістіть 20 мг тканини в мікроцентрифужну пробірку.
- Розщеплення тканини: ресуспендуйте осад тканини в 180 мкл розчину для лізису T.
- Додайте 20 мкл протеїнази К, перемішайте на вортексі.
- Інкубуйте при 55 °C протягом 2–4 годин або протягом ночі, доки тканина не буде повністю лізована.
Екстракція фенолом/хлороформом (органічна).
- Додайте 40-60 мг зубного порошку до 500 мкл EDTA.
- Інкубуйте при 37 °C протягом 3 днів.
- Додайте 1 мл буфера TRIS NaCl EDTA (TAE) з додецилсульфатом натрію (SDS) і додайте 10 мкл протеїнази К і перемішайте імпульсним вортексом протягом 15 секунд.
- Інкубуйте при 56°C протягом 24 годин.
Екстракція ДНК хвоста
- Хвіст розміром від 0,5 до 1 см розщеплюють у 500 мкл SE буфера/протеїнази K, 55°C протягом ночі.
- Додайте попередньо підігрітий насичений розчин NaCl (6М) 170 мкл, обережно перемішайте до кінцевої концентрації 1,5 М.
- Додайте 670 мкл хлороформу та перемішуйте протягом 30-60 хвилин обережним обертанням.
- Центрифугувати при 12000 об/хв протягом п’яти хвилин.
Комітет HMA наполегливо рекомендує це видалення кінчика хвоста виконується у віці від двох до чотирьох тижнів тому що молодші миші заживають швидше і мають менше кісток на кінці хвоста. Стандартне видалення кінчика хвоста використовується, коли діаметр відрізаного кінця хвоста становить 2 мм або менше (дитинчата мишей).